روش های شمارش بیوشیمیایی میکروارگانیسم ها

باز کردن اسرار شمارش میکروبی: کشف روش های بیوشیمیایی برای تجزیه و تحلیل دقیق:

در دنیای میکروبیولوژی، شمارش دقیق میکروارگانیسم ها برای طیف وسیعی از کاربردها بسیار مهم است. از ایمنی مواد غذایی گرفته تا نظارت بر محیط زیست، توانایی تعیین کمیت جمعیت میکروبی ضروری است. در این مقاله، ما به قلمرو شگفت‌انگیز روش‌های شمارش بیوشیمیایی می‌پردازیم و تکنیک‌ها و ابزارهای ابتکاری مورد استفاده برای دستیابی به نتایج دقیق و قابل اعتماد را بررسی می‌کنیم. در سفری به دنیای شمارش میکروب ها به ما بپیوندید و روش های پیشرفته ای را کشف کنید که کیفیت و دقت را در تجزیه و تحلیل کمی افزایش می دهد.

اندازه گیری وزن خشک:

این روش به اندازه­گیری مقدار توده زیستی می­پردازد. این تکنیک بسیار حساس بوده و احتیاج به وسایل دقیق و کالیبره آزمایشگاهی دارد.

در این روش سلول­ها شسته شده و پس از نگه­داری در دمای پایین، درون فور در دمای معین و در مدت‌زمان مشخصی قرار می­گیرند. پس از خشک شدن، وزن توده زیستی اندازه­گیری می­شود و به تعداد میکروارگانیسم ­ها نسبت داده می­شود­. این روش بسیار زمان­بر و حساس است و احتیاج به مهارت افراد متخصص در این حوزه دارد.

علاوه بر این، احتمال مداخله خطای انسانی و دستگاهی در آن بسیار زیاد است.  بنابراین پرواضح است که استفاده از چنین روشی برای ساخت کیت­های سریع شناسایی و شمارش میکروارگانیسم­ها مناسب نیست. مراحلی از عملیات مربوط به اندازه­گیری مقدار توده زیستی (Biomass) در شکل 17 نشان داده شده است.

شمارش میکروسکوپی مستقیم:

این روش معمولاً با شمارش مستقیم میکروارگانیسم­ها زیر میکروسکوپ نوری انجام می­شود. برای انجام این آزمون معمولاً از لام­های توما یا هموسایتومتر استفاده می­شود.

از معایب بزرگ این روش، شمارش باکتری­های زنده و مرده به­طور هم‌زمان است. هم­چنین احتمال خطا در شمارش و نیز اشتباه گرفتن حباب­های هوا به­جای میکروارگانیسم­ها هنگام شمارش نیز وجود دارد. برای فائق شدن بر این مشکل، لازم است پیش از بررسی میکروسکوپی نمونه بارنگ‌های ویژه­ای رنگ‌آمیزی شود و در چنین صورتی نیز به آگاهی و مهارت فرد متخصص لازم است.

روش شمارش میکروب­­های زنده:

برای تخمین تعداد جمعیت میکروب­های زنده، شمارش آن­ها معمولاً با تقویت رشد عمومی یا منحصربه­فرد آن­ها در محیط کشت­های جامد، مایع و نیمه جامد و یا با عبور از فیلتر‌های غشایی و رشد بر روی محیط کشت مغذی انجام می­شود. بنابراین این روش اساساً به سه دسته کلی روش شمارش کلنی، فیلتر غشایی و بیشترین تعداد احتمالی تقسیم می‌شوند.

روش شمارش پلیت:

در این روش نمونه مورد آزمایش پس از انجام یک رقیق­سازی سلولی متوالی در محیط کشت مایع و یا محیط­ های مناسب برای رقیق­ سازی، بر روی پلیت­های حاوی محیط کشت جامد آگاردار پخش می‌شوند و پس از مدت‌زمان مشخص انکوباسیون در یک دمای مناسب (متناسب با هر نوع باکتری متفاوت است و شرایط رشد می­تواند توسط پرتابل انکوباتور که به عنوان سرویس پشتیبانی معرفی شده است، بهینه شود)

تعداد کلنی­های شکل­گرفته شمارش می­شود و با اعمال ضریب فاکتور رقیق­سازی در نتایج، تعداد باکتری­های زنده موجود در نمونه اولیه (که هرکدام توانسته‌اند یک کلنی را بسازند) به‌صورت تعداد کلنی­های شکل­گرفته در واحد حجم (CFU/ml) به دست می‌آید. در این روش چنانچه رشد باکتری­های بی‌هوازی مدنظر باشد، باید ماده رقیق­کننده و شرایط کشت اصلاح شود تا اکسیژن هوا قبل از استفاده از بین برود.

ایراد اصلی این روش زمان انکوباسیون طولانی  (حداقل 24-72 ساعت)، نیاز به وجود فرد متخصص انجام دهنده آزمون و عدم رشد برخی بسیاری از باکتری­ها روی محیط جامد آگاردار (از هر 100 باکتری، 1 عدد رشد می‌کند) است. درهرحال شمارش پلیت روش مناسبی برای شناسایی و شمارش باکتری­ها نیست که البته بیشترین عدم تمایل به این روش، زمان انکوباسیون طولانی‌مدت برای رشد میکروارگانیسم­ها، مشکلات کالبدی و تاریخ انقضای پایین محصولات (به دلیل آبدار بودن محیط کشت آگار دار) مبتنی بر ین روش است.

با این حال محصولات متنوعی براساس این تکنولوژی در بازار موجود می باشند. شکل 19 شماتیکی از مراحل رشد باکتری بر روی پلیت و نمونه­ای واقعی از رشد باکتری­ها را بر روی پلیت بعد از رقیق­سازی سریالی، توزیع و انکوباسیون نشان می‌دهد.

روش فیلتراسیون غشایی:

این روش براساس استفاده از یک غشای سلولزاستات بسیار خلل و فرج دار با اندازه حفراتی است که اجازه عبور آب را می‌دهد اما اجازه عبور باکتری را نمی­دهد و باکتری­ها در آن به دام می‌افتند.

اندازه حفرات تقریباً -22/0 45/0 میکرومتر است. در این روش مقدار زیادی آب تحت‌فشار از درون فیلتر عبور می‌کند و سپس باکتری­های به دام افتاده در دمای مناسب بر روی محیط کشت مغذی مناسب (یا محیط جامد آگار و یا محیط مایع حبس شده درون پدهای جاذب محیط کشت مایع) نگه‌داشته می­شوند و متعاقباً پس از انکوباسیون تعداد کلنی­ها شمارش می­شود.

بزرگ‌ترین مزیت این روش در مقایسه با روش شمارش پلیت، بررسی حجم زیادی از نمونه در زمانی است که کم بودن تعداد جمعیت میکروب­ها شمارش آن­ها را مشکل می­کند. به‌هرحال در این روش احتیاج به حفظ شرایط استریل، وسایل و تمهیدات پیچیده جهت عبور آب از داخل خلل و فرج فیلترها و نیز مهارت افراد متخصص است. هم‌چنین به دلیل رشد کلنی بر روی بستر جامد (آگار و یا پد جاذب) زمان انکوباسیون و رؤیت کلنی قابل‌شمارش نیز طولانی است. با این حال محصولات متنوعی براساس این تکنولوژی در بازار موجود می­باشند. خلاصه‌ای از انجام این روش در شکل 20 نشان داده‌شده است.

 

روش بیشترین تعداد احتمالی (MPN):

روش بیشترین تعداد احتمالی یا MPN در بسیاری از موارد برای رشد میکروارگانیسم­ های زنده در محیط­ های کشت انتخابی بسیار ویژه و مایع استفاده می­شود

و بخصوص برای شمارش غلظت های پایین میکروارگانیسم ها (زیر 100 عدد در هر گرم) در شیر، آب و یا مواد غذایی که در روش شمارش کلنی اختلال ایجاد می کنند، مفید است. در روش MPN تنها میکروارگانیسم های زنده شناسایی و تعداد آن­ها تخمین زده می شود. فناوری­های مبتنی بر MPN به دودسته کلی روش لوله­ای (tMPN)  (3، 5، 9 و 15 لوله ای) و روش مینیاتوری (mMPN) تقسیم می شوند.

در روش MPN لول ه­ای، رقیق­سازی سریالی نمونه اولیه در محیط مناسب استریل انجام‌شده و کسری از هر نمونه رقیق‌شده به محیط کشت مایع موجود در لوله­ های مخصوص منتقل می­شود. پس از انکوباسیون در دما و زمان مشخص، نمونه‌ها ممکن است در هر لوله مه آلودگی ایجاد کنند و یا نکنند. براساس این مثبت و منفی بودن نتایج در هر لوله، هر نمونه یک کد عددی دریافت می‌کنند که این کد عددی به تعداد میکروارگانیسم­های موجود در نمونه اولیه براساس جدولی به نام MPN table  با ضریب اطمینان 95% تفسیر می­شود. این روش بیشتر برای شمارش باکتری­های مدفوعی مانند استرپتوکوک­های مدفوعی، کلیفرم/اشرشیاکلای در نمونه­های آبی و نیز برای باکتری­های کاهنده سولفات به کار می­رود.

روش MPN در واقع یک روش رایج برای اندازه‌گیری دانسیته میکروارگانیسم‌های زنده است که براساس کاربرد تئوری شمارش رشد مثبت آن­ها در یک سری نمونه رقیق‌سازی شده سریالی در لوله­های حاوی محیط کشت رخ می­دهد. این رشد مثبت می‌تواند براساس نوع محیط کشت مغذی به‌صورت تولید گاز در اثر تخمیر، تغییر رنگ، ایجاد کدورت، تابش فلوروسنس تحت UV نشان داده شود. رقیق سازی سریالی غلظت باکتری هدف موجود در نمونه با یک تخمین کمیّ همراه است.

از جمله مهم­ترین اصول روش MPN این است که باکتری‌ها در نمونه به‌صورت رندوم توزیع‌شده‌اند، باکتری‌ها از هم جدا هستند و باهم خوشه تشکیل نداده‌اند. بنابراین چنانچه باکتری­ها به‌صورت خوشه‌ای قرار گیرند، این روش برای شمارش آن‌ها مناسب نیست و تنها می‌توان به‌صورت کیفی حضور یا عدم حضور میکروارگانیسم­ها را نشان داد.

در هر لوله (یا مانند آن) که حاوی تلقیحات است حتی اگر یک ارگانیسم زنده وجود داشته باشد می‌تواند رشد و یا تغییر قابل‌شناسایی را ایجاد کند. چیستی روش MPN به رقیق‌سازی نمونه تا درجاتی از رقت که حاوی میکروارگانیسم زنده نباشد برمی­گردد. درنتیجه چنین پدیده‌ای تعداد لوله‌های دارای رشد مثبت در هرکدام از رقت‌ها، به غلظت باکتری در نمونه اولیه دلالت خواهد کرد و عدد MPN یا بیشترین تعداد احتمالی بدست می آید. برخی از جدول­های از پیش طراحی شده برای محاسبه MPN  در سایت غذا و داروی امریکا (FDA) موجود است.

معمولاً در روش MPN لوله­ای از چندین ظرف نگهدارنده استفاده می­شود. برای مثال در بکارگیری روش 15 لوله ای برای MPN، 15 لوله لازم است که از نمونه پر شود. تهیه رقت­های سریالی نمونه و پرکردن چندین ظرف جدا از هم فرآیندی زمان­بر است و ریسک آلودگی را افزایش می­دهد. بنابراین ساخت وسایلی که اجازه می­دهند حجم مشخصی از نمونه آبی درون لوله­هایی درون یک بستر توزیع شوند و جدا از یکدیگر قرار گیرند، استفاده از روش MPN را کاربردی­تر خواهند کرد که اساس روش MPN مینیاتوری است.

در روش MPN مینیاتوری، تعداد تکرار آزمایش در ابعاد کوچکتر افزایش می­یابد. معمولاً در این روش نیاز به رقیق­سازی متوالی نمونه اولیه وجود ندارد (اما ممکن است انجام شود). این روش معمولا در میکروپلیت های 96 خانه برای شمارش گونه خاصی از سلول­ها و بیشتر براساس اندازه­گیری میزان جذب UV خانه­ها انجام می­شود. پاسخ­های مثبت و منفی ناشی از رشد در هر خانه و مطابقت آن­ها با جدول مخصوص تهیه شده با نرم­افزار مطلب مطابق با روش استاندارد ISO-9308، تعداد باکتری­ها را نشان می­دهد.

استفاده از میکروپلیت امکان انجام تعداد زیادی آزمایش را در یک پلیت منفرد فراهم می‌کند. چراکه درواقع آزمایش کوچک‌سازی شده است و هر چاهک، حکم یک لوله‌آزمایش کوچک را دارد که در هریک حجم مشخصی از آب آلوده قابل ریختن است و این امکان را فراهم می­کند که عناصر مختلفی که برای شناسایی و ایجاد واکنش­های بیولوژیک و شیمیایی لازم است، بتوانند در کنار هم قرار گیرند. به­طور مثال افزودن مقداری از رنگ­های شاخص به محیط آلوده میکروبی در کنار مواد مغذی که اجازه می­دهد واکنشی مابین آنزیم­ها میکروبی و شناساگر­ها رخ دهد و یک تغییر قابل شناسایی ایجاد شود.

به ­هرحال استفاده از میکروپلیت­ها ایده خوبی برای ساخت کیت­هایی است که اساس شناسایی آن­ها روش MPN است. چنانچه محصولاتی مبتنی بر پلیت مانند Coliplate نیز به­طور تجاری در بازار موجود است. ساختارهای چاهکی هر پلیت اساس روش MPN را ایجاد می­کند.

بزرگ‌ترین مزیت روش­های مبتنی بر MPN، شمارش تعداد سلول­های بسیار کم است که نمی­توانند بر روی محیط آگاردار رشد ­کنند. تعداد شمارش‌شده با این روش اغلب بیشتر از روش­های شمارش در پلیت است. در این روش به دلیل رشد میکروارگانیسم­ها در محیط مایع، سرعت رشد بسیار بالاست.  شکل 21 خلاصه‌ای از این روش را به همراه نمونه­ای از جدول تفسیر نتایج نشان می­دهد.

 

به هرحال در روش لول ه­ای خطای آزمایش بالاست و به مصرف مواد اولیه بسیار زیادی نیاز است. اما در روش مینیاتوری به دلیل عدم نیاز به رقیق سازی متوالی نمونه احتمال خطای آزمون کم است و احتیاج به مواد اولیه بسیار کمتری نسبت به روش لوله­ایست، اما همچنان نیاز به مهارت اپراتوری خاص و یا تجهیزات پیچیده وجود دارد. در این روش به دلیل حذف شدن مرحله رقیق ­سازی سریالی و پخش نمونه اولیه در حفراتی با ظرفیت پذیرش مایعات یکسان، بازه ناچیزی از باکتری­ها قابل شمارش است و نمی­توان بازه گسترده ای از باکتری­ها را شمارش کرد.

روش/MBC MIC:

اصول جلوگیری از رشد باکتری بر پایه دو اصطلاح MIC و MBC میکروب‌شناسی استوار است. منظور از MIC، غلظتی از یک آنتی بیوتیک است که می‌تواند رشد باکتری را در شرایط آزمایشگاهی مهار کند؛ و منظور ازMBC، حداقل غلظتی از دارو است که باکتری را از بین می‌برد (می­کشد).

روش تعیین حداقل غلظت ممانعت کنندگی (I.C):

در این روش از لوله ­های آزمایش حاوی محیط کشت مایع استریل استفاده می­شود که در آن­ها ماده ضد میکروبی به صورت دوتایی (Doblicate) رقیق شده است.

سپس به همه لوله ­ها غلظت خاص و مشخصی از باکتری مورد نظر معادل نیم مک فارلند (cell/ml10⁸×5/1) اضافه می شود. در نهایت یک لوله حاوی محیط کشت و باکتری بدون حضور ماده ضد میکروبی برای تعیین کدورت رشد باکتری به عنوان شاهد رشد استفاده می­شود و یک لوله­ هم که نه باکتری و نه ماده ضد میکروبی در آن حضور دارند به عنوان شاهد برای بررسی آلوده نیودن محیط اولیه استفاده می­شود (یعنی باکتری اگر رشد نکند محیط کشت لوله شفاف باقی بماند).

نتیجه MIC بر اساس کدورت محیط کشت که نشان دهنده رشد باکتری است بررسی می‌گردد. یعنی در یک مرز میان لوله­های حاوی غلظت­های متوالی ماده ضدمیکروبی، رشد و عدم رشد میکروبی مشخص است. غلظت موجود در اولین لوله­ای که تا قبل از آن باکتری رشد داشته است و کدورت ایجاد شده است ولی در آن لوله رشدی مشاهده نشده است، به عنوان MIC در نظر گرفته می­شود.

روش تعیین حداقل غلظت کشندگی (B.C):

بعد از تعیین MIC در لوله­ها، محتوای لوله­ای که غلظت آن به عنوان MIC در نظر گرفته شده است توسط سوآپ استریل بر روی محیط کشت مولر هیلتون آگار کشت داده می­شود

و سپس پلیت‌ها به مدت 16 تا 18 ساعت در انکوباتور در دمای 35 درجه سانتی گراد نگهداری می­شوند. چنانچه بعد از کشت حداکثر سه کلنی بر روی  محیط کشت آگاردار مشاهده شد، آن غلظت از ماده ضد میکروبی به عنوان MBC در نظر گرفته می­شود.

از آنجا که غلظت خاصی از ماده ضدمیکروبی قادر است غلظت ویژه ای از باکتری­ها ( مثلاً cell/ml10⁸×5/1) را از بین ببرد، می­توان با آگاهی به این موضوع و به کارگیری آن غلظت ویژه از ماده ضد میکروبی در محیط کشت و سپس بررسی رشد یا عدم رشد باکتری­ها در این شرایط، به غلظت اولیه باکتری­ها پی برد و بدین ترتیب به تعداد آن­ها دست یافت.

 روش­های شناسایی و شمارش بیوالکتروشیمیایی (دستگاهی):

در روش­های بیوالکتروشیمیایی دستگاهی یک تغییر الکتروشیمیایی که در نتیجه فعالیت و عملکرد بیوشیمیایی درون سلول­های باکتریایی ایجاد شده است، توسط سیستم­های شناسایی دستگاهی برای تخمین توده زیستی میکروبی مورد سنجش قرار می­گیرد. هدف استفاده از این روش­ها در مقایسه با روش­های معمول، کاهش زمان برای شناسایی میکروارگانیسم‌ها و فراهم آوری یک پروب تکرارپذیر تشخیص توده زیستی ارزان، دقیق و سریع است.

 

روش های شناسایی بیوشیمیایی میکروارگانیسم ها – بخش اول

گرماسنجی میکرونی:

اطلاعات گرماسنجی نشان می­دهد که گرمای آزادشده ناشی از متابولیسم سلول­ها می‌تواند برای شمارش میکروارگانیسم­ها استفاده شود و می­توان مقدار گرما را به‌طور غیرمستقیم به تعداد آن­ها نسبت داد.

مقدار گرما به متابولیسم سلول­ها بستگی دارد که درواقع به مقدار زیست‌توده و مقدار اکسیژن جذب‌شده مربوط است. در این روش از دستگاه مانیتورینگ فعالیت گرمایی استفاده می­شود؛ اگرچه این روش یک وسیله­ای برای پایش آنلاین است، اما موفقیت­های محدودی به دست آورد.

اندازه گیری مقاومت الکتریکی:

دستگاه شمارنده کالتر توسط کمپانی Coulter Electronics Inc (کانادا) ساخته‌شده است و به طور گسترده برای شمارش میکروارگانیسم‌ها استفاده می‌شود.

در این روش سوسپانسیون باکتری از یک ‌روزنه کوچک عبور می‌کند که دو الکترود در اطراف آن آویزان هستند. مقاومت ایجادشده توسط روزنه با عبور جریان از الکترودها اندازه­گیری می‌شود. پالس­های ایجادشده توسط هر سلول تقویت می‌شود و به­طور الکترونی شمارشی از تعداد سلول­ها با عبور از روزنه ارائه می‌دهد. تعداد سلول­ها باید برای افزایش دقت شمارش در سطح پایینی باشد، چراکه به دلیل دانسیته بالای باکتری ممکن است روزنه بسته شود.  این مشکل با رقیق­سازی نمونه پیش از انجام آزمون برطرف می­شود. البته باید مراقب چروکیده شدن سلول­ها در اثر فشار اسمزی نیز بود. به‌هرحال هزینه ساخت چنین دستگاهی بسیار بالا است (38000 دلار). شکل 22 تصویر شماتیک این روش را نشان  می­دهد.

 

آنالیز ذرات الکترونی:

یکی دیگر از روش­های سریع و خودکار برای شمارش میکروارگانیسم­هاست که به‌طور ویژه تعداد و ابعاد ذرات موجود در نمونه­ های ادرار را که روی میدان الکتریکی تأثیر دارند نشان می­دهد، روش آنالیز ذرات الکترونی است.

این روش به‌طور گسترده برای شمارش میکروارگانیسم­ها و سلول­های موجود در ادرار استفاده می‌شود و روش بسیار سریعی است به­طوری که در هر ساعت 100 نمونه را روبش می­کند. اما عدم مزیت آن عدم تفکیک سلول­های زنده و مرده از یکدیگر است و قیمت بسیار زیادی دارد. این سیستم بانام RAMUS مطالعه شده است.

غشای پیزوالکتریک:

تشخیص پیزوالکتریکی زیست‌توده روشی است که در سال 1980 ارائه‌شده است و شامل انتشار امواج اولتراسونیک از سوسپانسیون باکتریایی و اندازه­گیری آن در سطح غشای پیزوالکتریک است.

در این روش، میرایی سیگنال خروجی نسبت به سیگنال ورودی، غلظت میکروارگانیسم را تخمین می‌زند. در این روش هر دو نوع مخمر و باکتری می‌توانند در غلظت‌های بالای ⁶ 10 سلول در هر میلی­لیتر شمارش شوند. این روش یک روش ارزان و آنلاینی برای تشخیص سلول­ هاست که حتی می‌توان با استریل کردن پروبش، آن را به‌صورت in situe استفاده کرد. به‌هرحال این روش تنها در غلظت‌هایی بالای میکروارگانیسم دارای عملکرد است و هم­چنین توانایی تشخیص سلول­ های زنده و غیرزنده از یکدیگر و از دیگر جامدات موجود در سوسپانسیون را ندارد. مکانیسمی از فرآیند عملکر غشای پیزوالکتریک در شکل 23 نشان داده شده است.

 

در این روش باید حتماً باکتری­ها از یک نوع باشند تا بتوان یک نتیجه منطقی میان تعداد باکتری و کدورت ایجادشده برقرار کرد . چراکه باکتری­ها ازنظر اندازه، شکل هندسی و غیره دارای تفاوت­های زیادی هستند که بسیار روی نتیجه اثرگذار خواهد بود. هم­چنین برای استفاده از این روش احتیاج به دستگاه کدورت سنج باقیمت‌های بسیار بالا است.

فتومتری:

این روش برای شمارش گروه خاصی از باکتری­ها که درون خود دارای رنگ‌دانه و یا پیگمنت هستند (مانند سیانوباکتر­ها)، استفاده می­شود.

با محاسبه میزان نور ساطع‌شده و یا جذب‌شده و مقایسه آن با نمودار کالیبراسیون می­توان به تعداد باکتری دست‌یافت. خلاصه ای از روش فتومتری در شکل 25 نشان داده شده است.

 

در این روش نیز باید حتماً باکتری­ها از یک نوع باشند تا بتوان یک نتیجه منطقی میان تعداد باکتری و نور ساطع‌شده و یا جذب‌شده برقرار کرد. هم­چنین برای استفاده از این روش احتیاج به دستگاه فتومتر باقیمت‌های نسبتاً بالا است. در این روش دقت در غلظت‌های پایین باکتری بیشتر از غلظت‌های بالاست. چراکه در غلظت‌های بالا نمودار رشد باکتری کمتر خطی است.

دانسیتومتری رزونانس آکوستیک:

زمانی که یک توده در فرکانس رزونانس خود است، فرکانس رابطه معکوسی با توده دارد. ازاین­رو برای مثال حجم ثابتی از محیط فرمنت شده، یک فرکانس رزونانسی دارد که با غلظت نمونه متناسب است.

این روش یک روش دینامیک است و اشرشیاکلای را در بازه 8 10 الی 12 10 به‌صورت آنلاین پایش می‌کند. بنابراین قادر به شمارش بازه وسیعی از باکتری­ها نیست. عدم مزیت دیگر این روش این است که قادر به تفکیک اجرام غیر زنده و زنده از یکدیگر نیست.

میکروسکوپ الکترونی:

از میکروسکوپ الکترونی روبشی و عبوری برای دیدن باکتری­ها روی غشای فیلتر شده …. استفاده شده­است.

اما به‌هرحال استفاده از این روش­ها برای چنین کاربردهایی اساساً غیرمنطقی است. در شکل 26 تصاویری از باکتری­های روئت شده با میکروسکوپ الکتروی روبشی مشاهده می­شود.

 

نفلومتری:

این روش،اندازه­گیری تعداد میکروارگانیسم­ها متناسب با سیگنال­های نور پراکنده‌شده از نمونه آبی حاوی توده زیستی است.

این روش در غلظت‌های کم باکتری بسیار کارآمد است (10⁵ باکتری در هر میلی‌لیتر). این روش مشابه کدورت سنجی قادر به شناسایی اجسام زنده و یا غیرزنده نیست و لازم است برای تخمین صحیح، یک‌گونه خاص از باکتری موردبررسی قرار گیرد. این روش زیاد در آزمایشگاه­ها استفاده نمی­شود.

 

اسپکتروسکوپی:

برخی از امواج مانند UV، مادون‌قرمز نزدیک، رامان و اندازه­گیری کننده رزونانس باکتریایی، از روش­های دارای پتانسیل برای شمارش تعداد سلول­ هاست. به‌هرحال این روش­ها بسیار گران هستند و استفاده از آن­ها منطقی نیست. هم­چنین تغییر در محیط کشت و مرحله رشد باکتری، شرایط استفاده از اسپکتروسکوپی را دشوار می­کند.

امپدیمتری و هدایت­سنجی:

محتوای میکروبی نمونه می‌تواند با مانیتورینگ متابولیسم­های میکروبی نسبت به توده زیستی شناسایی شود.

مواد مغذی محیط کشت متابولیزه شده، کوچک‌تر و دارای مولکول­های بسیار بارداری هستند که زمانی که آزاد می‌شوند منجربه تغییراتی در هدایت یونی محیط کشت می‌گردند که اساس این تکنولوژی است. هم­چنین تکنیک­های مبتنی بر اندازه­گیری تغییرات در ویژگی­های الکتریکی خود میکروارگانیسم­ها نیز توسعه‌یافته‌اند.

امپدانس یک مقاومت کلی الکتریکی برای جریان متناوب است که از طریق عبور از محیط کشت به وجود می­آید. معمولاً، امپدانس زمانی که هدایت و ظرفیت افزایش می­یابد، از مقدار امپدانس کاسته می­شود. در سیستم­های امپدیمتری زمانی که غلظت­های میکروبی به آستانه‌های مشخصی می‌رسند ( 10⁶-10⁷ باکتری در هر میلی‌لیتر یا 10⁴-10⁵ سلول مخمر)، تغییرات امپدانس مشخص می‌شود. زمانی که برای انکوباسیون نمونه­ای حاوی حتی یک میکروارگانیسم لازم است تا به این آستانه برسد را، زمان شناسایی امپدانس می‌گویند.

این زمان می‌تواند برای تخمین غلظت اولیه CFU هر نمونه استفاده شود، اما برای رسیدن به نتایجی قابل تکرار، ترکیب و درجه حرارت محیط باید مرتباً کنترل شود. در نمونه‌های ادراری، تعداد باکتری 10⁵ در هر میلی‌لیتر می‌توانند با IDT برابر 5/2 ساعت، شناسایی شود.

باکتومتر (Bactometer) وسیله ایست که با این فناوری ساخته‌شده است و از امپدانس برای شمارش جمعیت میکروبی در مدت زمان 24-48 ساعت و یا کمتر استفاده می‌کند. سیستم­های کاملاً خودکار کامپیوتری برای مانیتورینگ و رسم منحنی امپدانس وجود دارد که آن را با منحنی استاندارد رشد باکتری مقایسه می‌کند و برای این کار از نرم‌افزارهای ویژه‌ای استفاده می­کند.

وسیله‌ای دیگری به­نام Malthous 2000 یک تجهیز مبتنی بر کامپیوتر است که از مانیتورینگ هدایت الکتریکی برای تخمین جمعیت میکروبی استفاده می‌کند. محیط کشت­های انتخابی می‌توانند برای شناسایی انواع میکروارگانیسم­ها مانند کلیفرم­ها،  باکتری­های لاکتیک‌اسید، استافیلوکوکوس،  قارچ و مخمر استفاده شوند.

بزرگ‌ترین عدم مزیت روش­های امپدامتری و هدایت سنجی، طولانی بودن زمان انکوباسیون است که منجربه شکل­گیری سیگنال­های مربوط به رشد میکروبی می‌گردد و نیز هزینه بسیار بالای تجهیزات است. هم­چنین نیاز به افرادی بامهارت بالا در هنگام استفاده از آن وجود دارد.

 

پتانسیومتری:

اساس آنالیز پتانسیومتری اندازه­گیری پتانسیل ایجادشده در الکترود با ارجاع به الکترود رفرنس، مانند الکترود جیوه‌ای اشباع‌شده (SCE) است.

پتانسیل ایجادشده در الکترود با تولید هیدروژن توسط متابولیسم میکروارگانیسم­ها دنبال می‌شود. هم‌چنین برای میکروب­هایی که هیدروژن تولید نمی‌کنند، محاسبه پتانسیل الکترود از طریق پتانسیل اکسیداسیون که منجربه تغییراتی در پتانسیل رداکس محیط حمایت‌کننده میگردد و ازاین­رو تغییراتی در پتانسیل الکترود مانیتور ایجاد می­کند، انجام می­شود. این روش برای شناسایی بازه گسترده­ای از باکتری­ها به کار می­رود و مدت زمان پاسخ برای شناسایی 10⁶ باکتری در هر میلی­لیتر تقریباً 5/1 تا 5/3 ساعت است.

اگرچه این روش برخی ویژگی­هایی را مانند آسانی، قیمت پایین و حساسیت ارائه می‌دهد که به‌عنوان پروب برای مانیتورینگ زیست‌توده مناسب است، اما عدم مزیت­هایی نیز دارد؛ زمان تشخیص به رشد میکروبی وابسته است و بنابراین روش آنلاین نیست. هم­چنین احتمال اینکه فرآیند فرمانتاسیون تأثیرات بدی از حضور مواد اسیدی بگیرید نیز وجود دارد.  زمان تشخیص برای 10⁵ سلول در هر میلی‌لیتر حدود 7-8 ساعت است که بیش از روش‌های تشخیص فیزیکی دیگر مانند امپدیمتری می­باشد. اما به هرحال آسانی این روش احتمالاً اینکه آن را برای شناسایی فعالیت میکروبی در نمونه‌های غذایی، زیست‌محیطی و بالینی به روش رایج تبدیل کند، وجود دارد.

تکنولوژی سلول سوختی:

یک سلول سوختی یک وسیله‌ای است که برای تبدیل مستقیم انرژی شیمیایی به الکتریکی استفاده می‌شود و شامل یک آند، یک کاتد و یک محیط الکترولیتی حمایت‌کننده برای اتصال دو الکترود است.

هم­چنین یک­سری اتصالات مدار الکتریکی خارجی برای استفاده از الکتریسیته نیز وجود دارد. مطالعات نشان داده است که میکروارگانیسم­ها برای تولید جریان الکتریکی و نشان دادن افزایش جریان خروجی با ردیاب­های پتاسیم فریسانید یا بنزوکینون در محلول آنالیت ادغام می­شوند. متعاقباً با رشد خصوصاً با استفاده از مدیاتورها (ترکیبات رداکس با وزن مولکولی کم که الکترون­ها را میان ترکیبات بیولوژیکی و الکترود انتقال می‌دهد) درون سلول سوختی، میکروارگانیسم­ها یک سوبسترای مناسبی را در بخش­های آندی سلول اکسید می‌کنند که از بخش کاتدی با یک غشای نفوذپذیر پروتئینی جدا می­شود. مدیاتور یا سلول­های میکروبی کاهیده شده، مجدداً در آند اکسید می‌شوند. بنابراین الکترون‌ها از آند از طریق مدار خارجی به سمت کاتد جابجا شده و درنهایت یک پذیرنده الکترون نهایی مانند اکسیژن را کاهش می‌دهند. جریان ایجادشده در مدار خارجی قابل‌اندازه‌گیری است و به‌طور مستقیم به غلظت میکروبی وابسته است. به‌هرحال در این روش حجم زیادی از نمونه لازم است (ml 100) تا تغلیظ شوند تا یک پاسخ مناسب ایجاد شود. محدودیت این روش شمارش تعداد محدود 10⁶-10⁸ سلول در میلی‌لیتر است و زمان شناسایی تقریباً 30 دقیقه می­باشد.

 

آمپرمتری:

روش­های آمپرمتری برای شمارش زیست‌توده میکروبی براساس اندازه­گیری  جریانی است که از الکترود کار  ثابت‌شده در یک پتانسیل تعریف‌شده عبور می کند.

این پتانسیل مشخص از طریق اندازه­گیری پتانسیل پیک آندی آنالیت با استفاده از جریان CV تعریف می‌شود. روش آمپرمتری با استفاده از سیستم‌های دو و یا سه الکترودی انجام می‌شود. محدودیت شمارش در این سیستم‌ها 10⁶– 10⁸ باکتری در هر میلی‌لیتر نمونه است. محصول Biochech اولین محصول تجاری توسعه‌یافته مبتنی بر روش آمپرمتری است که در آنالیت آن از مدیاتور هم استفاده ­شده­است. این سیستم قادر است در انواع محیط­های آبکی فعالیت کند.

زیست­ حسگرهایی برای آنالیزهای بالینی گلوکز مبتنی بر آمپرمتری به‌واسطه الکترودهای آنزیمی واسطه ساخته‌شده‌اند. مکانیسم اندازه­گیری حس‌گر میکروب­های گوشت مبتنی بر شناسایی آنالیت شاخص (گلوکز) است که به‌طور مستقیم نشان‌دهنده فساد میکروبی مخازن نگهداری گوشت است. گلوکز در گوشت تازه وجود دارد و به‌طور طبیعی توسط میکروب­های فلور در سطح گوشت مصرف می‌شود. چنانچه میزان گلوکز کاهش یابد، فلور باکتری برای مصرف آمینواسیدها تغییر رویه می‌دهند و آمین­هایی تولید می‌کنند که منجر­به خراب شدن گوشت می­گردد. بنابراین چنانچه غلظت گلوکز در سطح در سطح ایمنی قرار داشته باشد، به مدت‌زمان انقضای آن مربوط می­شود.

سرویس خدمات:

تامین شرایط بهینه رشد (شامل تامین دمای بهینه رشد، تاریکی):

میکروارگانیسم­ها برای رشد باید دارای شرایط بهینه ای باشند که یکی از اساسی ترین آن­ها بعد از تامین آب و مواد مغذی، تامین دمای مناسب و تاریکی است. در شرایط آزمایشگاهی، از وسیله ای به عنوان انکوباتور برای کنترل شرایط مذکور استفاده می­شود.

انکوباتورها محفظه‌های بسته و ایزوله‌ای هستند که تا حد امکان از لحاظ دما و ورود و خروج گازها از فضای بیرون آن جدا شده اند. معمولاً، انکوباتورها دارای یک سیستم متشكل از مقاومت­هاي الکتریکی هستند که با ترموستات و یا مکیروپروسسور کنترل می شوند و براي سیستم­های انتقال گرما، از هدایت و یا همرفت طبیعی استفاده می­کنند. با استفاده از سنسورهای دمایی، دمای داخل انکوباتور سنجیده شده و  سیستم کنترل دمای موجود در آن از طریق ترموکوپل‌های معمولی یا سیستم های مبتنی بر میکرو کنترلرها و  plc، دمای داخل آن را  در حد تعیین شده ثابت نگه می‌دارد.

انکوباتورها به دو دسته کلاسیک و پرتابل تقسیم می­شوند؛ مدل کلاسیک معمولا دارای ابعادی بزرگ و بصورت رومیزی استفاده می­شوند و هزینه خرید آن­ها بالاست. در مقابل انکوباتورهای پرتابل معمولا برای کنترل شرایط دما و تاریکی برای مصارف کم در ابعاد کوچک استفاده می­شوند، مصرف انرژی آن­ها بسیار کم بوده و قابل حمل هستند. انکوباتورهای پرتابل معمولا بر روی پکیج برخی از محصولات بیولوژی مانند کیت­های تشخیصی ارائه می­شوند و موجب بهبود عملکرد کیت­ها می­گردند.

تامین امواج فلورسنت با طول موج خاص:

همانطور که پیش­تر بیان شد، ازجمله شناساگرهای گونه­ های ویژه باکتریایی عوامل فلوروژنیک هستند

که توسط آنزیم­های ویژه سلولی متابولیزه شده و یا طی فرآیندهای سلولی ویژه ای قادرند تحت امواج فلوروسنت مانند امواج UV، نوری در محدوده قابل دید انسان ایجاد کنند. اغلب شناساگرهای فلوروژنیک میکروبی این قابلیت را تحت امواج UV تک طول موج نشان می­دهند. بنابراین هنگام استفاده از محیط های کشت حاوی عوامل فلوروژنیک، باید از لامپ­های فلوروسنت (مخصوصاً لامپ­های UV) برای تشخیص استفاده ­شود.

لامپ­های فلوروسنت به دو دسته کلاسیک و پرتابل تقسیم می­شوند؛ مدل کلاسیک معمولا دارای ابعادی بزرگ اند و هزینه خرید آن­ها بیش از 100 دلار می­باشد. در مقابل لامپ­های فلوروسنت پرتابل برای مصارف کم و در ابعاد کوچک استفاده می­شوند و به راحتی قابل حمل هستند. لامپ­های فلوروسنت پرتابل معمولا بر روی پکیج برخی از محصولات بیولوژی مانند کیت­های تشخیصی ارائه می­شوند و شناسایی عامل شناساگر فلوروژنیک را میسر می­سازند.

نمونه برداری و آماده سازی نمونه:

یکی ازعناصرکلیدی در بررسی کیفیت میکروبی آب، نمونه­برداری و آماده­ سازی صحیح آن است.

در نمونه برداری آب برای آزمایش باکتری شناختی باید توجه داشت که آبی که به عنوان نمونه برداشته می شود، نماینده آبی باشد که می باید مورد قضاوت قرار گیرد.

برای جمع آوری و انتقال نمونه باید از بطری ها، ادوات و ابزار استریل شده استفاده شود و مقدار نمونه آب مورد نیاز برای انجام تست حتما مطابق با استانداردهای 1011 و 3759 باشد. قبل از نمونه برداری از آب بهتر است در نمونه عواملی که جلوی رشد میکروارگانیسم­ها را می­گیرند و اثر ممانعت کننده رشد دارند، از بین بروند. نمونه برداری از نمونه­های آبی مطابق با استاندارد ASTM 3370 انجام می­شود.

از جمله این عوامل کلر و هالوژن­های موجود در آب است که باید قبل از استریل شدن ظرف نمونه برداری، مقدار کافی تیوسولفات سدیم (Na₂S₂O₃) به بطری اضافه شود. توصیه می شود به همه بطری هایی که به منظور جمع آوری نمونه به کار می روند، تیوسولفات سدیم اضافه شود، مگر هنگام کشت باکتری­هایی مانند باکتری­های کاهنده سولفات که تیوسولفات ممکن است در فرآیند رشد آن­ها تغییراتی ایجاد کند. هم­چنین فلزهای سنگین موجود در نمونه های آبی پیش از کشت توسط نمک دی سدیم EDTA خنثی می­شوند. pH مناسب رشد باکتری­ها نیز هم در محیط کشت مغذی و هم در مراحل آماده سازی نمونه توسط نمک­های بافرکننده به حد مطلوب می­رسد.

در کیت­های تشخیصی بیولوژی معمولاً ادوات نمونه­برداری همراه با دستورالعمل نحوه استفاده، نمک­های پیش­تیمار، ادوات پیش­تیمار فیزیکی مانند فیلتراسیون نمونه­های حاوی ذرات جامد و ظروف استریل یکبار مصرف مناسب برای انتقال و حمل نمونه وجود دارد.