روش های شناسایی بیوشیمیایی میکروارگانیسم ها – بخش اول

 محیط کشت (مواد مغذی):

هنگامی‌که باکتری‌ها در شرایطی مناسب قرار گیرند که قادر به تکثیر و رشد باشند اصطلاحاً گفته می‌شود که باکتری کشت داده‌شده است. ازآنجاکه میکروب­ها موجودات تک‌سلولی هستند، قادرند کلیه اعمال حیاتی خود را مستقلاً انجام دهند، بدون آنکه نیاز به سلول دیگری داشته باشند. این اصل بیانگر آن است که میکروب‌ها هم احتیاج به غذا و آب و مواد آلی و معدنی دارند. از اینرو محیطی مغذی که حاوی کلیه احتیاجات یک میکروب اعم از مواد غذایی، عناصر آلی و معدنی و غیره باشد و موجب رشد آن میکروب شود را اصطلاحاً محیط کشت یا ماده مغذی می‌گویند.
محیط کشت می‌تواند به‌صورت مصنوعی و یا به طور طبیعی (یعنی داخل سلول‌های بدن یک جانور دیگر) باشد.خون بهترین محیط برای رشد یک باکتری است چراکه تمام احتیاجات یک باکتری اعم از اکسیژن ، مواد مغذی ، PH مناسب، درجه حرارت لازم و غیره را برای یک باکتری فراهم می‌کند.
میکروب‌ها می‌توانند بر روی محیط‌ها و در ظروف مختلف کشت داده شوند که انتخاب شکل ظروف بستگی به نوع کشت دارد. مثلاً در کشت‌هایی که محیط آن مایع (براث) است، ظروف کشت لوله‌ای می‌باشد و محیط‌های جامد (آگاردار) هم در پلیت و هم در لوله کشت داده می‌شوند. بیشتر محیط‌های کشت که در پلیت مصرف می‌شوند، محیط‌های کشت عمومی هستند که اساساً برای تهیه مواد غذایی لازم جهت رشد باکتری ساخته‌شده‌اند.

بعضی مواقع با اضافه کردن اجزای مغذی به محیط­های کشت عمومی و غنی کردن آن­ها موجب افزایش سرعت رشد میکروارگانیسم‌های سخت رشد می‌شوند. ماهیت این مواد مغذی چنان است که نمی‌توان آن‌ها را همراه با محیط اصلی سترون کرد، بلکه باید بعد از اتوکلاو شدن محیط به‌طور سترون این مواد اضافه شوند. نمونه‌هایی از این مواد مغذی عبارت‌اند از : شیر بی‌چربی ، خون گوسفند ، زرده تخم‌مرغ و ….

محیط کشت می‌تواند هر نوع ماده غذایی به‌صورت محلول یا سوسپانسیونی حاوی آب باشد که باکتری­ها قادرند درون آن تکثیر یابند. مادی مغذی پایه‌ای می­تواند گلوکز، سوکروز، فروکتوز، عصاره گوشت گوساله، پپتون، نوترین براث (ترکیب عصاره گوساله و پپتون)، تریپتون، شیر، نصف و نصف با خامه، عصاره مخمر و یا هرگونه ترکیبی از این مواد باشد که مواد کربنی، نیتروژن، فسفر، انرژی و دیگر احتیاجات تکتیر میکروارگانیسم­ها را فراهم می­کند.

انواع محیط کشت: 

– محیط­ کشت انتخابی:  
بعضی از مواد مغذی دارای یک عامل انتخابی هستند که ویژه جداسازی یا کشت گروه خاصی از میکروب‌هاست . عامل انتخابی معمولاً با جلوگیری از رشد ارگانیسم‌های نامطلوب عمل می‌کند و از این راه موجب رشد شدیدتر ارگانیسم‌های مطلوب می‌شوند. وقتی عامل انتخابی به محیط کشت اضافه می‌شود در این صورت محیط کشت را انتخابی می‌گویند. به‌عنوان‌مثال ، سدیم کلرید آگار برای استافیلوکوک­ها انتخابی است.

-محیط­های افتراقی:    
محیط‌های کشت افتراقی اجزایی دارند که موجب می‌شوند برخی از ارگانیسم­ها در مقایسه با باکتری‌های دیگری که درهمان محیط کشت رشد می‌کنند به شکل متفاوتی ظاهر شوند. مثلاً بعضی از باکتری‌ها خاصیت همولیز دارند بدین معنا که تولید آنزیم همولیزین می‌کنند که این آنزیم در محیط آگار خون‌دار باعث پاره شده (لیز شدن) گلبول‌های قرمز شده و کلنی آن در محیط کشت به رنگ روشن دیده می‌شود. این همولیز ممکن است ناقص و یا کامل باشد.
سایر محیط‌های افتراقی اغلب دارای یک معرف pH هستند. مثلاً محیط آگار آهن‌دار 3 قندی (TSI) از این نوع است. محیط‌های کشت افتراقی به ­ویژه زمانی مفیدند که با میکروب­هایی با شکل و مشخصات یکسان مواجه هستیم. اغلب محیط­های کشت هر دو ویژگی را با هم دارند مانند مکانکی آگار(MC) . این محیط دارای نمک­های صفراوی و مقدار بسیار کمی کریستال ویوله است که هر دو از رشد باکتری­های گرم­ مثبت جلوگیری می کنند. همچنین دارای لاکتوز و معرف pH قرمز خنثی است که کلونی های تخمیرکننده لاکتوز را به رنگ قرمز در می آورد و ممکن است در محیط اطراف کلنی ها حلقه قرمز رنگ تشکیل دهند و کلنی باکتری­هایی که قادر به تخمیر لاکتوز نیستند بی رنگ دیده می­شوند.

-محیط غنی شده:
این محیط­ها معمولاً در مواردی به­کار می روند که تعداد میکروب­های مورد جستجو در نمونه غذایی کم بوده و یا به­علت وجود زیاد میکروب­های دیگر جداکردن آن با اشکال مواجه است. این محیط­ها امکان رشد برای میکروب­ها را از نظر PH و موادغذایی فراهم می­سازد.

-محیط کشت کامل:    
این محیط دارای تمامی مواد لازم برای رشد باکتری­ها است و فاقد هرگونه مواد ضد میکروبی است و حدود 80% از باکتریها می­توانند در آن رشد کنند. این محیط ­ها فاقد هر گونه مهارکننده و اندیکاتورهای دیگر هستند و لذا با رشد میکروب­های مختلف بر روی آن هیچ­گونه تغییر رنگی مشاهده نمی­شود. در این میان برخی محیط ­ها مانند محیط  P.C.A(پلیت کانت آگار) در مقایسه با محیطی مانند N.A (نوترینت آگار) از کیفیت مغذی بالاتری برخوردار بوده و برای رشد میکروب­ها مناسب­تر است.

-محیط­ کشت جامد:  
محیط­رهای کشت جامد بعلت دارا بودن ماده آگار در ترکیب خود به­صورت جامد می­باشند. آگار یک نوع آلگ دریایی می­باشد که برخلاف ژلاتین می­تواند حرارت 37 درجه را که برای رشد تمام باکتری­های بیماریزای انسان مناسب است را تحمل نماید و هیچ میکروبی نمی­تواند آنرا ذوب و هضم نماید. آگار ساختمان پلی­ساکاریدی دارد که بوسیله برخی از جلبک­های دریایی ساخته می­شود. نقطه ذوب آن 95 درجه و نقطه انجماد آن حدود 43 درجه سانتی­گراد است .

-مورفولوژی کلنی­ها بر روی محیط کشت جامد

مجموعه‌ای از باکتری‌ها که بر روی سطوح محیط کشت در کنار یکدیگر رشد می‌کنند و براثر رشد و تکثیر، تشکیل نقاط برجسته‌ای روی محیط کشت می‌دهند که اندازه، شکل و رنگ (مورفولوژی) آن­ها متفاوت بوده و بستگی به نوع باکتری، نوع محیط کشت، میزان رشد و تکثیر باکتری دارد را کلنی (پرگنه) می‌نامند. یکی از راه های تشخیص، شناسایی و تمیز دادن گونه­ های مختلف باکتریایی از یکدیگر همین تفاوت­های موجود در مورفولوژی آن­ها در انواع محیط کشت است. شکل6 به طور شماتیک مورفولوژی­های مختلف کلنی­های باکتریایی را نشان می­دهد.

حرکت سنجی باکتری­ها بر روی محیط­ های کشت نیمه جامد

محیط­ های کشت نیمه جامد مانند SIM به منظور بررسی حرکت میکروارگانیسم­ ها استفاده می­شوند. قوام نیمه جامد بودن محیط نیز اجازه پخش شدن و در نتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری های متحرک می دهد. این محیط­ ها معمولا در لوله­ها آزمایش قرار دادرند و پس از تلقیح عمودی آن­ها توسط سوزن کشت (آنس)، حرکت باکتری بواسطه پخش شدن کلنی­های آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد. باکتری های فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است، کدر می کنند.

این محیط ­ها معمولا شامل عوامل شناساگر دیگری نیز هستند که همگس در کنار یکدیگر به شناسایی گونه باکتری کمک می­کنند. به­ طور مثال در محیط کشت SIM، مواد اولیه تولید اندول یعنی اسید آمینه تریپتوفان در پپتونهای محیط موجود است. هم­چنین هیدروژن سولفوره و سولفات نیز در محیط وجود دارد. ایجاد هیدروژن سولفوره توسط باکتری به صورت سیاه شدن محیط ظاهر می گردد و در صورت متحرک بودن باکتری کشت شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است، انتشار می یابد. سیاه شدن محصول واکنش هیدروژن سولفوره تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه رنگ می باشد. با اضافه کردن یک میلی لیتر معرف کواکس Covacs و یک میلی لیتر کلروفرم به کشت ۲۴ ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید ایندول توسط باکتری است. باکتری های که حاوی مجموعه آنزیم هایی که اصطلاحا تریپتوفاناز نامیده می گردند، باشند، قادرند طی سری واکنشهای شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند. شکل 7 تصاویری از حرکت­ دو نوع باکتری­ مختلف را در یک محیط کشت نیمه جامد نشان می­دهد.

شناساگرها

• شناساگرهای کروموژنیک

بیشتر شامل محیط های مغذی برای کشت باکتری­ها هستند که برای تشخیص، شناسایی و شمارش سریع و ساده میکروارگانیسم­ها به کار می روند و به سرعت در حال جایگزین شدن با روش­های کلاسیک و قدیمی اند و اخیراً موضوع مهمی در حوزه میکروبیولوژی هستند. تمرکز بر روی چنین تکنولوژی هایی بیشتر بر روی تولید محیط های کشت­هایی است که فرایند تشخیص و شناسایی میکروارگانیسم­ها را سریع­تر و واقعی­تر انجام دهند. در این فناوری از بسترهای مصنوعی برای تشخیص فعالیت­های آنزیمی میکروبی استفاده می شود. استفاده از مشتقات متفاوت متابولیت­ها و کروموفورها امکان شناسایی فعالیت­های مختلف آنزیم را در یک آزمون فراهم می­کند.

به طور مثال محیط­های حاوی سوبسترای ONPG، X-Gal یا X-Glu همگی یک محیط انتخابی ویژه ای می­سازند که همان محیط کروموژنیک است. یک عامل کروموژن می­تواند با چشم غیرمسلح (بصورت اپتیکی) با مشاهده مستقیم یک تغییر رنگ مشخص در محیط کشت شناسایی شود. در بسیاری از مواقع تایید حضور میکروارگانیسم هدف بدون انجام تست­های بیشتر امکان­پذیر است. از مزایای استفاده از محیط های کروموژنیک شامل نتایج سریعتر (نسبت به روش­های قدیمی)، تشخیص چشمی قابل اطمینان (اغلب بدون نیاز به تست­های بیشتر) و امکان انجام تست­های بیشتر به طور مستقیم از محیط کشت است.

• شناساگرهای فلوروژنیک

یک سوبسترای فلوروژنیک ماده ای غیر فلوروسنت است که توسط یکسری از آنیزی­های ویژه فعال شده و یک ترکیب فلوروسنت ایجاد می­کند. سوبستراهای فلوروژنیک در انواع مختلفی موجود هستند که با انواع فسفاتازها و آنزیم­ها دیگر واکنش­ می­دهند. استفاده از عامل فلوروژنیک برای تشخیص مثبت و منفی بودن حضور باکتری بسیار کاربردی است، چراکه ممکن است در غلظت‌های پایین میکروارگانیسم‌ها در نمونه، شناسایی انجام شود و از اینرو سرعت شناسایی نسبت به روش­های کروموژنیک افزایش یابد؛ از بهترین شاخص‌های فلوروژنیک می‌توان به مواردی مانند  4-methylumbelliferyl phosphate, 4-methylumbelleferyl-B-D-glucopyranoside, L-phenylalanine-7-amido-4-methylcoumarine, 4-methylumbelliferyl acetate, 4-methylumbelliferyl sulfate. اشاره کرد.

• شناساگرهای اکسایش-کاهشی

شاخص‌های اکسایش-کاهش (اredox indicator dyes) اغلب در طی یک فعالیت آنزیمی در سلول­های زنده تغییرات بسیار سریعی را در یک محدوده کروموژنیک یا فلوروژنیکی ایجاد می­شود. در واقع این عوامل شناساگر توسط آنزیم­های ویژه (مانند آنزیم‌های دهیدروژناز موجود در زنجیره تنفس باکتری­های هوازی) اکسید و یا احیا می­شوند و یک تغییر قابل پیگیری را ایجاد می­کنند. شدت این تغییرات با افزایش فعالیت­های بیولوژیکی که وابسته به تعداد سلول­های زنده است افزایش می­یابد؛ این افزایش و تقویت شدن فالیت­های بیولوژیکی با همان فرآیند افزودن نمونه آلوده باکتریایی به مواد مغذی محیط کشت انجام می­ شود. بررسی شدت تغییرات و یا مثبت و منفی بودن تغییرات اطلاعات مفیدی راجع به گونه­های باکتریایی زنده و غلظت آن­ها در اختیار می­گذارد.

باید دقت کرد که هنگام استفاده از عوامل شناساگر اکسایس-کاهشی در صورت وجود غلظت زیادی از برخی از عوامل شیمیایی مانند مواد آنتی­باکتریال یا بایوساید در نمونه آبی یا محیط کشت که ذاتاً ماهیت احیاکننده و یا اکسید کننده دارند، شناساگر بصورت خودبخودی دچار واکنش­های اکسایشی-کاهشی کاذب می­شوند. به طور مثال رنگ رزازورین در حالت اکسید آبی رنگ و در حالت احیا صورتی رنگ است. این شناساگر اگر در کنار غلظت‌های بالایی از مواد کاهنده بایوسایدی استفاده شود، رنگ صورتی به‌سرعت شکل بگیرد و این پدیده تنها و تنها می­تواند به دلیل ماهیت کاهنده خود ماده بایوساید باشد نه به دلیل فعالیت­ آنزیم­های موجود در سلول­های زنده.

رنگ­های اکسایش و کاهش در بیولوژی دارای اهمیت ویژه‌ای هستند. به­طور مثال این رنگ­ها قادرند در سیستم‌های انتقال اکسیژن مانند زنجیره انتقال الکترون موجود در غشای باکتری­های هوازی زنده با اکسیژن به‌عنوان آخرین گیرنده الکترون رقابت کنند و با دریافت الکترون و چرخش آن در حلقه­های موجود در ساختار شیمیایی‌شان تغییرات رنگی ایجاد کنند که نشان‌دهنده یک فعالیت سلولی ویژه مانند تنفس است. به‌عنوان‌مثال رنگ رزازورین که در بالا هم مورد بررسی قرار گرفت، در هر مرحله از کاهیده شدن با دریافت الکترون به حالت‌های مختلف رزوروفین و هیدرورزوفورین تبدیل می­شود که ساختارهای شیمیایی آن­ها در شکل 8 آورده شده است. رزازورین حالت اکسیدشده و آبی رنگ است که در صورت زنده‌بودن و تنفس باکتریایی با دریافت الکترون به صورتی تغییر رنگ می‌دهد و چنانچه بیش‌ازحد کاهیده شود و هیچ‌گونه اکسیژنی در محلول وجود نداشته باشد، محلول بی­رنگ می­شود. بنابراین کاملاً مشخص است که رنگ‌های شناساگر نشان دهنده فعالیت سلولی ویژه­ای هستند و هرکدام به‌نوعی به قادرند گونه­ خاصی از باکتری­های زنده را نشان می­دهند.

رنگ‌های شناساگر اکسایش-کاهشی مهم دیگری که در میکروبیولوژی و بیولوژی بسیار استفاده می­شوند شامل تترازولیوم بنفش، 2-یدوفنیل-3-پی نیتروفنیل-5-فنیل-تترازولیوم کلراید، متیلن بلو، رنگ فورمازان می­باشند. رنگ‌های فورمازان ترکیبات بسیار رنگی را تشکیل می‌دهند که تشخیص و استفاده از آن‌ها در روش اسپکتوفتومتری آسان و مفید است.

• شناساگرهای متابولیکی

شناساگر­های متابولیکی در واقع مواد مغذی و اغلب پروتئینی مصرف شونده توسط سلول­های زنده هستند که تنها توسط آنزیم­های ویژه ای در سلول­ها می­توانند مورد استفاده قرار گیرند. پیوندهای ویژه موجود در این مولکول­های مغذی توسط آنزیم­های ویژه­ موجود در یک نوع ارگانیسم خاص شکسته می­شود. بخش­های این مولکول پس از مصرف اغلب ماهیتی کروموژنیک و یا فلوروژنیک دارند و می­توانند معرف موجود آنزیمی ویژه و بنابراین گونه خاصی از باکتری­ها باشند. در ادامه این بخش در قسمت آنزیم­های متابولیزه کننده توضیحات بیشتری در این خصوص داده شده است.

• شناساگر­های اسید و باز

شناساگرها یا معرف های pH  موادی هستند که با کمک آنها می‌توان تشخیص داد که محلولی اسیدی یا بازی است. با افزودن مقدار کمی از یک شناساگر به یک محلول، تشخیص اسیدی یا بازی بودن آن محلول با تغییر رنگ شناساگر از یک شکل به شکل دیگر ممکن می‌شود. با توجه به رنگ مشاهده شده، می‌توان تعیین کرد که pH  محلول کم‌تر یا بیشتر از مقداری خاص است. در میکروبیولوژی و بیولوژی از این گونه مواد برای شناسایی محصولات فرعی اسیدی یا بازی حاصل از رشد میکروارگانیسم­های خاص استفاده می­کنند. به­طور مثال باکتری­های کلیفرم چنانچه از لاکتوز در فرآیند تخمیر به عنوان منبع قندی استفاده کنند، محصول حاصل از رشد آن­ها گاز کربن دی اکسید است که با انحلال در محیط آبی کشت، به اسید کربنیک تبدیل شده و pH محیز را کاهش می­دهد. در اینصورت چنانچه یکی از معرف­های اسیدی-بازی مناسب مانند فنول رد در محیط رشد این باکتری­ها وجود داشته باشد، اسیدی شدن محیط که نشان از حضور باکتری­های کلیفرمی است را بصورت تغییر رنگی از قرمز به زرد نشان می­دهد.

• شناساگرهای رادیواکتیو (فناوری رادیومتری)

در این فناوری ویژه، میکروارگانیسم پس از مصرف متاببولیکی یک عامل رادیوایزوتوپ که معمولاً کربن 14 (C14) است، برچسب گزاری می‌شود. در طی فرآیند متابولیسم میکروبی، گاز کربن دی‌اکسید برچسب دار تولید می‌شود که می­تواند توسط یک سنتیلاتور (آشکارساز مواد رادیواکتیو) شناسایی ‌شود و براساس کالیبراسیون به تعداد باکتری­های موجود نسبت داده می‌شود. استفاده از این شناساگر به شناسایی میکروارگانیسم­هایی محدود می‌شود که قادرند منبع کربن رادیوایزوتوپ را متابولیزه کنند. به هرحال این روش دارای حساسیت بسیار بالایی است و می‌تواند برای پایش آلودگی میکروبی آب و مواد غذایی به کار رود، اما برای پایش آنلاین مناسب نیست و به مهارت اپراتوری بسیار بالایی احتیاج دارد.

بایوساید و مواد کشنده میکروارگانیسم­ها

از بایوسایدها و مواد آنتی­بیوتیک برای کنترل رشد میکروبی و جلوگیری از تجمع میکروب­ها به ترتیب در آب‌های صنعتی و بدن موجودات زنده استفاده می‌شود. در تمام موارد این مواد برای جلوگیری، کاهش و کنترل رشد حضور میکروارگانیسم‌ها، باکتری‌های مضر و میکروارگانیسم‌های با رشد مشابه استفاده می‌شود؛

میکروارگانیسم­های مختلف به مواد بایوسایدی و آنتی بیوتیک­های مختلف پاسخ­های متفاوتی می­دهند. داروهای آنتی­بیوتیک اریترومایسین، پنی­سیلین، تتراسایکلین و … جزو دسته‌ای بزرگ از داروها هستند که باعث متوقف شدن رشد باکتری­ها (باکتریواستاتیک) و یا از بین بردن باکتری‌ها (باکتریوسایدال) می‌شوند. هر دسته از آنتی­بیوتیک‌ها بر روی باکتری­های خاصی تأثیر دارد و بر روی ویروس­ها یا سایر میکروارگانیسم‌ها تأثیری نخواهند داشت.

برای دانستن اینکه چه آنتی­بیوتیکی بر روی چه باکتری‌هایی مؤثر است، باید تست آنتی­بیوگرام انجام شود که معمولاً به صورت روتین در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی انجام می‌گیرد. این تست به ما نشان می‌دهد که هریک از آنتی­بیوتیک‌ها بر روی کدام باکتری مؤثر است. در آخر با انتخاب و تجویز نوع داروی موثر برای از بین بردن آلودگی، بهبودی سریعتر صورت گیرد. شکل 9 تصویری از دیسک­های حاوی آنتی بیوتیک­های مختلف با غلظتی یکسان را بر روی یک گونه خاصی از باکتری کشت داده شده بر روی سطح محیط کشت آگاردار نشان می­دهد. هرچه هاله عدم رشد اطراف هر دیسک بزرگتر باشد، نشان دهنده این است که آن باکتری نسبت به آنتی بیوتیک موجود در آن دیسک دارای حساسیت بیشتری است.

با توجه به توضیحات بالا، با آگاهی نسبت به حساسیت باکتری­های مختلف به آنتی بیوتیک­ها و مواد بایوسایدی ویژه و به کار بردن غلظت مناسبی از این مواد در محیط­های کشت باکتریایی، اگر شرایط برای رشد گونه باکتری مقاوم به آنتی بیوتیک مناسب باشد، باکتری موجود در نمونه رشد خواهد کرد و از رشد باکتری­های حساس به آن آنتی بیوتیک جلوگیری به عمل می­آید. بنابراین یکی از راه­های تمایز دادن گونه های مختلف باکتریایی استفاده از مواد جلوگیری کننده از رشد گونه های خاصی از باکتری­هاست.

علاوه بر آنتی بیوتیک­ها، برخی نمک­ها، دترجنت­ها و مواد طبیعی با عملکردی مشابه نیز در محیط های کشت مورد استفاده قرار می گیرند. به طور مثال از نمک های صفراوی در محیط های کشت باکتری­های  کلیفرم برای جلوگیری از رشد باکتری­های گرم مثبت استفاده می­شود. باکتری­های گرم منفی نسبت به این نمک مقاوم هستند و بنابراین به راحتی درون محیط کشت رشد می کنند و بنابراین می توان تشخیص داد که احتمالا گونه رشد کرده در محیط کشت کلیفرم باشد.

روش های شناسایی بیوشیمیایی میکروارگانیسم ها – بخش دوم