روش های شناسایی بیوشیمیایی میکروارگانیسم ها – بخش دوم

روش­های برپایه سنجش مولکولی

تکنیک فیلتراسیون اپی­فلوروسنس:

میکروسکوپ فلوروسنس یک متد بسیار سریع برای شمارش میکروب­ها فراهم می‌کند و احتیاج به هیچ زمانی برای انکوبه شدن وجود ندارد. موفق­ ترین روش در این نوع شناسایی، روش فیلتر اپی فلوروسنس  مستقیم (DEFT) است که نخستین بار برای تشخیص و شناسایی آلودگی­ های شیر خام به کار رقت، اما برای موارد دیگر نیز استفاده می‌شود. در این تکنیک نمونه مایع از یک فیلتر غشایی استریل عبور کرده و سپس ماده فلوروکروم آسیردین نارنجی به فیلتر اضافه‌شده و پس از مدت‌زمان اندکی تماس، فیلتر شسته می‌شود.  در نهایت باکتری­ها توسط میکروسکوپ فلوروسنس شمارش می­شوند. اگرچه این روش بسیار سریع است، اما احتیاج به فرد متخصصی برای انجام آن است و احتمال ایجاد خطای انجام دهنده آزمون بسیار است؛ هم­چنین احتیاج به تکنولوژی میکروسکوپ فلوروسنت دارد.

روش های شناسایی بیوشیمیایی میکروارگانیسم ها – بخش اول

تکنیک فلوروسنت-آنتی بادی:

این تکنیک برای شمارش گروه­ ویژه‌ای از  میکروارگانیسم­ها به‌صورت in Situe به­ کار می­رود. این تکنیک به‌عنوان یک روش بسیار حساس رنگ­ سنجی توسعه‌یافته است. این روش پتانسیل بسیاری برای کاربرد در حوزه­ های مختلف میکروبیولوژی دارد که منجربه پایش آنلاین زیست‌توده در فرمانتور و کپک‌ها شده است. در این روش با تزریق اجزای میکروارگانیسم به داخل بدن حیوان آزمایشگاهی ،آنتی‌بادی مکمل آن جز (مثلاً پروتئین‌های غشایی) ساخته می‌شود. پس از خالص­ سازی این آنتی‌بادی‌ها و برچسب زدن مواد فلورسنت به آن­ها (مانند ایزوتیوسانات فلوروسین)، آنتی­بادی­های برچسب خورده را با نمونه در سطح فیلتر تماس می‌دهند. اگر میکروب خاصی وجود داشته باشد، به آنتی‌بادی مکمل خود متصل شده و ازاین طریق باکتری به‌صورت فلورسنت زیر میکروسکوپ نمایان می‌شود.  شکل زیر شماتیکی از این تکنیک را یه صورت مستقیم و غیر مستقیم نشان می دهد.

عدم مزیت این روش، محدود بودن انواع آنتی‌بادی مکمل میکروارگانیسم­های ویژه است. بنابراین برای توسعه‌ی چنین روشی باید تعدادی انواع آنتی‌بادی‌ها توسعه یابد. همچنین استفاده از آنتی‌بادی بسیار هزینه‌بر است و اغلب برای حفظ و نگهداری آن­ها به محیطی یخچال­دار نیاز است.

بیولومینوسنس:

بیولومینوسنس یک روش سریع و بسیار حساس برای شناسایی باکتری‌هاست. سنجش براساس این فرضیه است که سلول­های زنده یک‌گونه مشخص باکتری، دارای میزان ثابت آدنوزین تری فسفات (ATP) هستند که به‌سرعت هنگام مرگ سلولی از بین می‌رود. اندازه­گیری ساده این ماده، واکنش آن با لوفرین است که توسط آنزیم لوفریناز کاتالیز می‌شود  و درنهایت منجربه تولید یک فوتون نوری می‌گردد. . در ادامه واکنش انجام شونده از این طریق در شکل زیر بیان‌شده است.

یک فوتون رنگی در هر هیدرولیز مولکول ATP تولید می‌شود که می‌تواند با فتومتر اندازه­گیری شود که حساسیتی حدود ^4-10 مول ATP دارد؛ نور تولیدشده متناسب با میزان ATP موجود است و بنابراین غلظت ATP در نمونه، تعداد میکروارگانیسم‌های موجود در آن را نشان می‌دهد. به علت حساسیت بالای این روش، سرعت شناسایی تقریباً ده دقیقه است. این روش در نمونه­هایی مانند شیر و آب احتیاج به زمان بیشتری دارد. چراکه زمانی اضافی لازم است تا سایر ATP های غیرباکتریایی موجود در سلول­های سوماتیک از بین بروند. هم­چنین در سلول­هایی که فعالیت بیشتری دارند، مقدار ATP بیشتر است و در سلول­هایی که فعالیت کمتری دارند، مقدار ATP کمتر است، بنابراین ممکن در شمارش خطا وجود داشته باشد. علاوه براین، یک فوتومتر با قیمتی نسبتاً گران لازم است تا میزان نور خروجی را اندازه­گیری کند.

برهم­کنش آنتی ژن-آنتی بادی (میکروالایزا):

این تکنیک برای تخمین زیست‌توده باکتری­ها از جمله باکتری­های SRB به کار می­رود. در این روش آنتی‌بادی‌ها در محیط کشت با استفاده از گلوتارآلدهید به آنزیم کنژوگه می­­شوند. کنژوگه حاصله هم فعالیت آنزیمی دارد و هم فعالیت ایمونولوژیکی. این روش بیشتر برای تشخیص آنتی‌بادی، آنتی­ژن و بیماری­های عفونی بدن انسان است و نتایج آن کمتر از 10³ سلول را در میلی‌لیتر شناسایی می‌کند. نتایج نشان می‌دهد که تعداد شمارش شده با این روش در مقایسه با تکنیک شمارش پلیت و MPN تعداد بیشتری است. این روش احتیاج به چندین مرحله شستشو دارد.

در این روش از نانوذرات مغناطیسی که آنتی‌بادی­ها بر سطح آن‌ها ایموبلایز شده­اند هم استفاده کردند. پس از 10 دقیقه تماس این ذرات با نمونه، میکروارگانیسم­ها جذب سطح شده و پس از جدا کردن آن‌ها و انتقالشان به محیط کشت اختصاصی، نوع باکتری شناسایی می­شود (Dynabead). درزمینه الایزا و ادغام آن با روش­های الکترونی مطالعات زیادی شده است که جای بحث آن در این مطلب نیست. شکل زیر خلاصه­ای از این تکنیک را نشان  می­دهد.

این روش­ اگرچه حساسیت بالایی دارد اما آنلاین نیست و تهیه آنتی بادی­ها هزینه­بر است و نگهداری آن­ها در دمای یخچال است. در این روش برای انجام مراحل شناسایی به مهارت اپراتوری بالا نیاز است.

نوکلئیک اسید:

واحدهای سازنده DNA و RNA است و به‌طورکلی در تمام سلول­های زنده موجود است و ممکن است به‌عنوان شاخص کلی زیست‌توده میکروبی استفاده شود. عدم مزیت این روش کلی شامل عدم تمایز میان باکتری­ها از زیست‌توده‌های دیگر و قارچ می‌باشد. خطاهای فرآیندی می‌توانند به دلیل نوکلئوتیدها و پپتیدهایی که وزن مولکولی کمتری دارند و با طیف جذب از طریق ایجاد یکسری واکنش­های رنگی مداخله می‌کنند، ایجاد شوند.

واکنش زنجیری پلیمراز (PCR) موافقت­ های زیادی را به‌عنوان تکنیک تقویت نوکلئوئیک اسید به‌صورت نمایی کسب کرده است و معمولاً برای تحقیقات و کاربردهای بالینی استفاده می‌شود. امروزه، این روش ممکن است برای آنالیزهای کیفی به کار رود که نیازمند تلاش­های بسیار برای تهیه تمپلت DNA قبل از تقویت و انحلال محصولات DNA با ژل الکتروفورز است. به‌هرحال نیاز به اطلاعات کمّی با کاربردهای ویژه منجربه توسعه بیشتر روش PCR شد.

محققان نشان دادند که میزان PCR تولیدشده شدیداً متناسب با غلظت DNA اولیه است. استفاده از اتیدیم برماید اخیراً به‌عنوان روش استاندارد برای تلاش­های کمّی روش­های  مبتنی بر PCR و DNA در ژل الکتروفورز استفاده می­شود. روش PCR با استفاده از فلورومتر یتانسیل این را دارد که بتواند سریع و با حساسیت بالا باشد. فلوروکروم­های متفاوت می­توانند برای مشخصه­یابی پرایمرهای PCR به­کارگرفته شوند. خلاصه ای از مکانیسم و مراحل انجام PCR در شکل 13 نشان داده شده است.

روش کمّی  PCRمسقیماً در ژل آگارز بسیار حساس و توانایی شناسایی کمتر از 10 سلول در هر میلی­لیتر را دارد و زمان آزمون تقریباً 3 ساعت است. به دلیل اینکه این­روش نسبتاً پیچیده و هزینه­بر است، روش PCR معمولاً به عنوان ابزار آنالیز آزمایشگاهی استفاده می­شود. به­هر­حال ممکن است در آینده روش های کاملاً خوکار، سریع، ساده و ارزان توسعه یابد.

پروتئین:

اندازه‌گیری محتوای پلیمری از طریق تخمین نیتروژن موجود در سلول­ها برای اندازه­گیری مقدار توده زیستی به کار می‌رود. در این روش سلول­ها شسته شده و سپس از مدیا و محیط خارج سلولی ترشح‌شده توسط سانتیریفیوژ جدا می‌شوند. محتوای نیتروژن کلی سلول­ها می­تواند با روش micro-Kjeldahl یا واکنشگر Nessler تخمین زده شود. مقدار نیتروژن به‌دست‌آمده می‌تواند در فاکتور 25/6 ضرب شود تا  محتوای پروتئینی نمونه به دست آید. این روش و نتایج به دست آمده از آن به اندازه بسیار زیادی به فاکتورهای متابولیکی، نیتروژنی و فیزیولوژیکی بستگی دارد و بنابراین صحت و اعتبار این روش سوال­برانگیز است. تصاویر واقعی از تجهیزات مورد نیاز برای انجام اندازه­گیری مقدار نیتروژن نمونه در شکل 14 نشان داده شده است

لیپیدها و مشتقات آن­ها

فسفولیپیدها از ترکیبات اصلی غشای سلولی همه سلول‌های زنده هستند، اما محصول ذخیره‌ای در میکروارگانیسم­ها نیستند. این روش شامل استخراج  و بیرون کشیدن محتوای لیپیدی با استفاده از حلال مناسب است که متعاقباً از آن طریق می‌توان به دیگر شاخص‌های توده­زیستی مانند ATP دست‌یافت.  مقدار فسفولیپید میکروارگانیسم­ها از 4-91 میلی‌گرم در هر گرم وزن خشک متغیر است. باکتری‌های گرم منفی حاوی مقدار مشخصی پلیمرهای لیپوپلی­ساکاریدی در غشای خارجی هستند که می­توانند یک مبنایی را برای شناخت زیست­توده ایجاد کنند. هم­چنین این تست برای اندازه­گیری سلول­های زنده است و مقدار در حد پیکوگرم در هر گرم را شناسایی می­کند. لیپوپلی­ساکارید باکتری­ها بلافاصله پس از مرگ از بین می­رود. ولی چندین مشکل همراه با این روش وجود دارد. مثلاً استخراج کمّی لیپوپلی­ساکاریدها از نمونه بسیار دشوار است.

فسفات/کربن سلولی

اندازه­گیری کربن و فسفات سلولی شاخص نشانگر رشد هستند. روش‌های خودکار شده‌ای در دسترس است که برای تشخیص مقدار کربن کلی در مواد بیولوژیکی استفاده می­شوند. برای تشخیص فسفات، سلول­ها توسط سانتیریفیوژ جدا می‌شوند و در حضور ترکیب تری اسید هضم شده و سپس رنگ­سنجی می­شوند. عدم مزیت این روش آن است که برداشت و شستشوی سلول­ها می‌تواند منجربه از دست رفتن سلول­ها و در مرحله بعد منجربه نشت ترکیبات محلول در آب شود که منجربه عدم تخمین توده زیستی می‌گردد. هم­چنین نیاز به ادوات پیچیده و مهارت اپراتوری برای شستشو و جداسازی نمونه وجود دارد.

آنزیم‌های متابولیزه کننده و آنزیم­های اکسایش-کاهش

باکتری­ها معمولاً دارای آنزیم­های ویژه ای هستند که یا با آنزیم­های موجود در باکتری­های دیگر مشترک است و یا در سایر باکتری­ها وجود ندارد. از این ویژگی باکتری­ها می توان برای شناسایی باکتری­های ویژه استفاده کرد. در میان آنزیم­های موجود می­توان از آنزیم­های متابولیزه کننده (هیدرولیزکننده) و آنزیم­های احیاکننده (اضافه کننده هیدروژن) نام برد.

آنزیم­های متابولیزه کننده:

آنزیم­های متابولیزه کننده قادرند ماده مغذی خاصی را که در محیط کشت وجود دارد در طی فرآیند متابولیسم مصرف کرده و آن­ها را از مکان­های خاص پیوندی در ساختار مولکول بشکنند و به مواد کوچکتری تبدیل کنند. مواد کوچکتر معمولا دارای ویژگی کروموژنیکی یا فلوروژنیکی هستند و درصورتی که غلظت حضور آن­ها زیاد شود (افزایش غلظت از طریق فرآیند کشت دادن در محیط های مغذی رشد حاوی مواد متابولیزه شونده، انجام می­شود)، می توانند معرف حضور همه باکتری­های دارای آن آنزیم خاص شوند. به عنوان مثال کلیفرم­های دارای آنزیم‌های متابولیزه کننده ویژه­ای به­نام بتا-گالاکتوزیداز هستند که در شرایط معمولی یک سوبسترای گالاکتوپیرانوزیداز را هیدرولیز می‌کنند.

فرمولاسیون مورد استفاده برای تغلیظ غلظت عامل معرف این باکتری­ها شامل سوبسترای مغذی پروتئینی حاوی ONPG است. کلیفرم موجود در نمونه قادر است ONPG  مغذی شناساگر را متابولیزه ‌کند و پیوندهای میان پروتئین­های مغذی (گالاکتور-پیرانوزید) و پروتئین شاخص (ارتو-نیتروفنل، ONP) را از طریق فرآیند هیدرولیز بشکند. زنجیره پروتئینی مغذی باقی مانده مصرف می­شود و مجدداً برای رشد مورداستفاده قرار می­گیرد. پروتئین شناساگر مولکولی بعد از فرآیند شکست و آزاد شدن از پروتئین مادر زردرنگ است ( زمانی که به پروتئین مادر OPNG متصل است، بی‌رنگ می­باشد). برای هر مولکول ONPG که توسط کلیفرم­ها متابولیزه می‌شود، یک ONP زردرنگ آزاد می‌شود که نشان‌دهنده حضور باکتری­های کلیفرم در نمونه است. از آنجا که هیچ‌یک از باکتری­های هتروتروف نمی‌توانند ONPG را در طول 24 ساعت متابولیزه کنند، بنابراین تشخیص به‌طور ویژه تأیید کننده حضور کلیفرم در نمونه است.

 مکانیسم تشخیص مثبت باکتری اشرشیاکلای نیز مشابه همین روش است. اگر باکتری اشرشیاکلای در نمونه موجود باشد، می­تواند عامل مغذی-شناساگر MUG را به­طور مکمل هیدرولیز کند که منجربه تولید پروتئین‌های مغذی گلوکورونید و پروتئین فلورسنت (متیل-آمبلی فرون) می‌گردد استفاده از این روش نیاز به تست‌های تأییدی و یا کشت‌های ثانویه‌ای که بسیار زمان بر هستند را از بین می­برد. شکل 15 شماتیکی از عملکرداین سوبستراها را برای شناسایی کلیفرم نشان می­دهد.

آنزیم­های اکسنده-کاهنده:

آنزیم ­های اکسنده-کاهنده (مانند آنزیم‌های دهیدروژناز موجود در زنجیره تنفس باکتری­های هوازی یا آنزیم­های احیاکننده سولفات در باکتری­های کاهنده سولفات) یک واکنش شیمیایی اکسایش و یا کاهش را کاتالیز می­کنند. در برخی مواقع در حین انجام این فرآیند محصولات فلوروسنت، رنگی و یا محصولات فرعی شناساگری (مانند گاز H₂S، گاز CO₂) ناشی از کاهش یا اکسایش یک پیش ماده ایجاد می­شود که می­تواند معرف حضور یک نوع آنزیم ویژه در نوع خاصی از باکتری باشد. با تشدید غلظت ماده تولید شده شاخص در طی فرآیند کشت در محیط های مغذی ویژه می­توان حضور یا عدم حضور باکتری ویژه­ای را در نمونه اولیه تشخیص داد.

به­طور مثال باکتری­های احیاکننده سولفات معمولاً در محیط­های بی­هوازی سولفات را احیا کرده و به گاز سولفید هیدروژن و یا سولفید­های محلول تبدیل می­کند. چنانچه شرایط برای ادامه واکنش فراهم باشد، در طی یک فرآیند آنزیمی اکسایشی دیگر، سولفیدهای محلول به رسوبات فلزی رنگی و یا فلوروسنت تبدیل می­شوند. شماتیکی از این فرآیند در شکل 16 نشان داده شده است.